Associação Brasileira de Patologia do Trato Genital Inferior e Colposcopia

Biologia molecular (PCR, hibridização in situ e captura híbrida) no diagnóstico das infecções por HPV

Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Nelson Valente Martins
José Focchi

1. Considerações gerais

O Papilomavírus Humano é um DNA vírus epiteliotrófico cujo capsídeo de 55 nm encerra genoma circular contendo cerca de 8.000 pares de bases. Originalmente esses vírus eram classificados em conjunto com os poliomavírus formando um grupo taxonômico único chamado Papovaviridae.

Na atualidade, entretanto, diferenças no tamanho dos vírions (50 nm para os poliomavírus) e nos padrões de replicação justificaram a sua separação em dois grupos distintos. O sistema atual de tipagem dos HPV’s é baseado em eventuais diferenças nas regiões de E6/E7 e L1 do genoma viral.

Um novo tipo de HPV deve, por definição, apresentar homologia menor que 90% com outros tipos virais em relação a essas regiões. Um sub-tipo viral apresenta, por sua vez, de 90% a 98% de similaridade para essas regiões, considerando-se variante viral aquele vírus que possui homologia maior que 98% (van Ranst et al, 1993).

1.2. O genoma dos papilomavírus

A organização molecular do genoma dos Papilomavírus pode ser melhor entendida de acordo com a figura 1.

Figura 1

Os genes que compõe o genoma viral dos HPV’s podem ser divididos em dois grupos funcionais: Late “L” (genes tardios) e Early “E” (genes precoces). Vale ressaltar que na região de transição entre os genes tardios e precoces existe uma região controladora da expressão genética e da replicação do DNA não mostrada na figura 1.

Gene E1

A região codificadora do gene E1 leva à produção de uma fosfoproteína de 68 kDa com atividade helicásica e ATPásica intrínseca além de possuir alta afinidade pelo DNA. A proteína E1 em conjunto com a proteína E2 formam o complexo E1-E2 sendo esse de extrema importância nos mecanismos de replicação viral.

Gene E2

A proteína codificada pelo gene E2 além de controlar a transcrição de outros genes como E6 e E7 parece possuir atividade estimuladora da função da proteína supressora do crescimento tumoral p53, de fato alguns autores demonstraram que a expressão de E2 pode resultar em apoptose (Desaites et al 1997).

Gene E3

Não existe função estabelecida para esse gene até o momento sendo que os Papilomavírus humanos não possuem esse gene.

Gene E4

A função da proteína codificada pelo gene E4 ainda está para ser melhor esclarecida acreditando-se que a sua produção esteja ligada à diferenciação terminal dos queratinócitos. A interação entre a proteína E4 e as citoqueratinas resulta para alguns na formação da coilocitose (Doobar et al 1988) (Roberts et al, 1997).

Gene E5

Esse gene não aparece em todos os tipos de HPV além de poder estar truncado em alguns outros. À proteína E5 tem-se atribuído papel relacionado a transformação induzida por HPV’s tipo 1, 6 e 16 (Crusius et al 1997).

Com relação às taxas de proliferação celular, a proteína codificada pelo gene E5 parece ainda operar em conjunto com o Fator de Crescimento Epidermóide (EGF) no sentido de favorecer a proliferação celular.

Gene E6

A proteína E6 desempenha importante papel nos processos que culminam com transformação celular neoclássica em especial pelo fato dessa proteína interagir de maneira a acelerar os mecanismos de degradação fisiológica da proteína supressora do crescimento tumoral p53, fenômeno esse que interfere profundamente nos mecanismos de apoptose e reparo do DNA.

Figura 2

A função plena da proteína p53 favorece a atividade de outra proteína chamada p21 a qual por sua vez diminui a atuação das ciclinas dependentes de quinase levando a parada do ciclo celular.

O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é um co-fator importante na interação entre a fita de DNA e a enzima DNA polimerase delta durante a divisão celular. A proteína p21 estimulada por p53 condiciona inibição do PCNA favorecendo também a parada do ciclo celular.

O gene denominado GADD 45 está envolvido nos mecanismos de reparo do DNA e, ao contrário dos outros dois genes, tem sua atividade estimulada pela proteína p21. Dessa forma podemos entender agora que, se a p53 estiver inoperante, um eventual dano genômico que condicione, por exemplo, a ativação de um oncogene será transmitida para células-filhas garantindo um clone de células com vantagens de crescimento em relação às células normais. Em outras palavras podemos dizer que a célula infectada por HPV apresenta-se em um estado de instabilidade genômica. Constatou-se também que E6 interage com as proteínas MCM (minichromossome manteinance) as quais acredita-se exercerem importante papel regulador nos processos de replicação do DNA.

Outras funções de E6 incluem:

ativação da enzima telomerase favorecendo mecanismos de imortalização celular,

transativação da seqüência promotora do oncogene c-myc,

induz aumento na expressão do Receptor do Fator de Crescimento Epidermal (EGFR).

Gene E7

Da mesma forma que E6, a proteína codificada pelo gene E7 também exerce papel importante nos mecanismos de transformação celular, não através de p53 mas por interagir com a proteína supressora de tumores pRb (retinoblastoma) e aumentar sua degradação através da via ubiquitina-proteassomo, a mesma via envolvida na degradação de p53.

Outros pontos de interação com E7 incluem a proteína p21 (Figura 2), p27, ciclina A, além de membros da família de fatores de transcrição AP-1.

Genes L1 e L2

Os dois genes tardios (Late) L1 e L2 codificam para as duas proteínas do capsídeo viral.

Integração do genoma viral ao genoma humano

O genoma dos HPV’s, por razões ainda não esclarecidas, pode integrar-se ao genoma humano sendo essa etapa fundamental para a transformação neoplásica. Durante o processo de integração parece haver preferência por áreas do genoma humano próximas a oncogenes. Quanto ao genoma viral, esse quase que invariavelmente é rompido ao nível das regiões E1/E2 as quais, entre outras coisas, controlam a transcrição dos genes E6 e E7.

Nessa condição, E6 e E7 encontrar-se-ão livres de controle transcritivo e, dessa forma, poderão efetivamente interferir nos mecanismos de controle do ciclo celular, como discutido acima. Os tipos virais que com mais freqüência se integram ao genoma humano são os tipos 16 e 18, entretanto, a integração viral também é observada nas infecções virais dos tipos 31, 33 e 35. Esses cinco tipos virais são os mais encontrados nas lesões intra-epiteliais precursoras e no próprio carcinoma escamoso do colo uterino.

Figura 3

É importante ressaltar nesse momento, que as infecções por HPV isoladamente não são capazes, por si só, de induzir progressão para neoplasia invasora. De fato, acredita-se hoje que menos de 2% das lesões induzidas por esse vírus evoluirão para invasão o que demonstra, indubitavelmente, a necessidade de outros eventos moleculares para o surgimento do fenótipo invasivo.

2. Diagnóstico molecular das infecções pelo HPV

O diagnóstico colposcópico, citológico e anátomo-patológico do HPV já foi discutido no capítulo anterior. Abordar-se-á, nesse momento, o diagnóstico que se dá pela detecção da presença do DNA viral em amostra a ser estudada.

Muito embora o padrão ouro de detecção de DNA do HPV seja o “Southern blot”, a sua execução rotineira é laboriosa, dessa forma na prática diária, são basicamente três as técnicas biomoleculares utilizadas na detecção de DNA do HPV, são elas: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), Captura Híbrida e Hibridização In Situ.

PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método que se utiliza da síntese enzimática de DNA, determinando amplificação específica e exponencial de um determinado fragmento desse ácido nucléico milhões de vezes. O DNA a ser estudado pode ser coletado por escova endocervical, lavado vaginal ou fragmento de biópsia fresco ou incluído em parafina.

Essa técnica utiliza-se de enzima capaz de sintetizar DNA a partir de apenas uma cópia dessa molécula em reação que inclui aquecimento e resfriamento sucessivos. Essa enzima foi isolada de algas (Thermus aquaticus) capazes de sobreviver em altas temperaturas no parque de Yellowstone nos EUA.

A importância do método no diagnóstico das infecções por HPV reside no fato de tratar-se de procedimento simples, rápido, automatizado e extremamente específico. A utilização de duas seqüências de DNA complementares (primers ou seqüências iniciadoras) e específicas para um determinado tipo viral permite a amplificação do DNA desejado mesmo que presente em quantidades ínfimas.

Pode-se ainda lançar mão dos chamados “degenerateprimers” os quais possibilitam, em um único tubo, a pesquisa da presença de vários tipos virais simultaneamente. Nessa eventualidade existe ainda a necessidade de estudo complementar com enzimas de restrição para se determinar com exatidão o(s) tipo(s) virais.

Outras aplicações da técnica de PCR incluem isolamento de novos genes (DD-PCR, RAP-PCR), detecção de translocações e análise da expressão genética (RT-PCR) além de ser possível estimar-se a carga viral.

Captura híbrida

Técnica molecular extremamente específica e de fácil execução que fornece a tipagem viral por grupos (alto e baixo risco) além de permitir estimativa da carga viral em determinada amostra. Sondas de RNA complementares a áreas específicas do genoma da maioria dos tipos virais são utilizadas. Caso existam partículas virais, os híbridos formados entre o DNA viral e as sondas específicas são capturados na parede do tubo de reação recobertos com anticorpos específicos marcados com fosfatase alcalina.

As sondas não reagentes são lavadas e a detecção da reação é feita através de adição de substrato quimioluminescente da fosfatase alcalina. A conseqüente emissão de luz é lida por luminômetro sendo a intensidade da luz proporcional à quantidade de HPV na amostra, esse fato, permite avaliar quantitativamente a carga viral.

A captura híbrida, rotineiramente, pode ser realizada em material colhido por escova e biópsias não incluídas em parafina.

Hibridização in situ

A hibridização in situ constitui técnica que permite a localização de ácidos nucleicos dentro das células, estejam estas nas células ou em preparados citológicos representativos. Da mesma forma que os outros métodos, baseia-se no pareamento complementar de sondas especificamente projetadas para detectar-se tipo viral específico. As referidas sondas são previamente marcadas com substâncias como biotina ou digoxigenina podendo utilizar-se também de material radioativo se necessário.

Sem dúvida nenhuma a maior das vantagens com relação à técnica de hibridização in situ diz respeito à possibilidade de detectar-se não somente o tipo viral e a sua localização das áreas infectadas mas principalmente o estado físico do vírus, se epissomal ou incorporado ao genoma da célula hospedeira.

É crescente o número de autores que se utilizam dessa técnica com resultados e conclusões importantes principalmente no que tange à presença de partículas virais incorporadas ao genoma e seu papel prognóstico (Cooper et al 1997). Demonstra-se claramente que as lesões pré-invasivas HPV induzidas com padrões de hibridização puntiforme (Figura 3) possuem partículas virais incorporadas ao genoma constituindo-se em marcador prognóstico importante.

Vale lembrar que a etapa de incorporação ao genoma da célula cervical uterina é fundamental para o estabelecimento da neoplasia invasiva sendo a hibridização in situ o único dos métodos citados que possibilita identificar e seguir pacientes onde o HPV se encontra nesse estado.

A hibridização in situ pode ser realizada em material blocado em parafina, raspados citológicos ou ainda em biópsias congeladas.

3. Método de coleta do material

Quando presente o vírus localiza-se em todo o trato-genital inferior, entretanto sua localização morfológica é quase sempre restrita a um seguimento, p. ex. colo do útero, ou vagina, ou vulva. Mas, reafirmamos sua presença é global em todo o TGI.

Recomenda-se, portanto, coleta com escova única e apropriada da endocérvice, da ectocérvice, das paredes vaginais, e da face interna dos pequenos lábios. A região da vulva, recoberta por pele, deve ser escarificada com lâmina de bisturi e o material enviado no mesmo frasco do material anteriormente recolhido.

Com essa técnica propiciamos ao laboratório material abundante e o diagnóstico de presença ou ausência de HPV no TGI é suficiente para a adoção de conduta terapêutica que será baseada no local e na gravidade da lesão morfológica.

4.Indicações de procedimentos com biologia molecular na prática médica

Ressalte-se que a conduta terapêutica a ser adotada é sempre embasada no perfeito diagnóstico morfológico (citopatologia, colposcopia e biópsia). Entretanto o conhecimento do tipo e da carga viral possibilita vislumbrar com clareza o prognóstico da lesão em questão, esse fato torna o estudo biomolecular importante ferramenta na escolha do método terapêutico.

Eis as principais indicações da biologia molecular:

pacientes com lesão morfológica, para escolha do método terapêutico;

seguimento das pacientes tratadas por neoplasia intra-epitelial, em especial, as de alto grau;

rastreamento de pacientes assintomáticas, mas com suspeita epidemiológica;

seguimento de pacientes imunodeprimidas, com especial atenção para as com soro HIV positivo.

estudo retrospectivo para a pesquisa de HPV em material blocado ou lâmina citológica (hibridização in situ).

A possibilidade de coleta conjunta de material para estudo citológico e para testes biomoleculares abrangendo além do HPV a pesquisa de outras DST’s, tais como, gonococos, clamídeas, fungos (Cândida), CMV (Citomegalovírus), toxoplasmose, EBV (Epstein-Barr Vírus) abre interessante perspectiva no diagnóstico da patologia do trato-genital inferior.

5. Literatura recomendada

SONNEX, C. Human papillomavirus infection with particular reference to genital disease. J Clin Pathol 51: 643-648, 1998.

BERNARD, HU; CHAN, SY; MANOS, MM; ONG, CK; VILLA, LL; DELIUS, A; PEYTON, CL; BAUER, HM and WHEELER,CM. Identification and Assesment of Known and Novel Human Papillomaviruses by Polimerase Chain Reaction Amplification, Restriction Fragment Lengh Polymorphism, Nucleotide Sequence and Phylogenetic Algorithms, 1994.