Associação Brasileira de Patologia do Trato Genital Inferior e Colposcopia

Captura híbrida: a nova metodologia em biologia molecular

Dr. Gerson Botacini das Dôres

Hoje há grande preocupação em relação ao correto diagnóstico das doenças. Com as mudanças comportamentais, principalmente as sexuais, observou-se aumento na incidência das doenças de transmissão sexual. Conseqüentemente, há grande interesse em diagnosticá-las e tratá-las adequadamente. Se não forem diagnosticadas com precisão, pode-se ter sérias complicações, como, por exemplo, a esterilidade e o câncer do colo uterino.

Em virtude da dificuldade diagnóstica com os métodos morfológicos e sorológicos, a biologia molecular teve grande avanço nos últimos cinco anos. As técnicas de biologia molecular, detectando diretamente o DNA/RNA de diversos agentes infecciosos, apresentam alta acurácia, permitindo diagnóstico seguro e conduta terapêutica efetiva.

Dentre essas técnicas destaca-se a Captura Híbrida.

A Captura Híbrida é um sofisticado teste qualitativo e quantitativo de hibridização molecular, com amplificação do sinal dos híbridos formados, que são detectados através de reação enzima-substrato e leitura por quimioluminescência. O material para análise passa por cinco procedimentos: Desnaturação; Hibridização; Captura dos Híbridos; Reação dos Híbridos com o Conjugado e Detecção dos Híbridos por Quimioluminescência.

1. Primeiro passo: desnaturação

Para a detecção de agentes infecciosos sangüíneos (HBV, CMV e HIV) a primeira etapa, após a coleta, é a preparação das amostras. Isso se faz necessário porque a partir dessa preparação o procedimento técnico da Captura Híbrida é igual para todos os agentes que se quer pesquisar.

Adiciona-se ao espécime solução de NaOH com pH entre 13 a 14, o que produz, associado a alta temperatura, o rompimento de vírus e bactérias e a quebra das pontes de hidrogênio. Isso expõe as bases nitrogenadas que ficarão livres para a etapa de hibridização. Além disso, há desnaturação de RNase, proteínas, fosfatase alcalina e híbridos RNA-DNA previamente existentes. Em adição, a solução de NaOH com esse pH, impede que após a diminuição da temperatura as fitas simples de DNA voltem a se anelar.

Para o diagnóstico de HPV, Clamídia, Gonococos e futuramente HSV, essa etapa é obrigatoriamente realizada no próprio tubo de coleta da Digene juntamente com a escova ou cotonete, pois a solução conservante já contém elementos importantes para esta fase do teste. Esta etapa dura 45 minutos.

2. Segundo passo: hibridização

Adiciona-se a sonda diluída em tampão e o pH se torna neutro. Os alvos DNA combinam-se com sondas RNA-específicas criando os híbridos RNA-DNA.

No que respeita ao HIV, a sonda que irá hibridizar com o RNA do vírus, formando híbridos DNA-RNA, é DNA biotinilada. Esta etapa dura uma hora.

3. Terceiro passo: captura dos híbridos

Depois de hibridizado, o material é transferido para uma microplaca ou tubo que tem suas paredes recobertas por anticorpos monoclonais universais específicos para RNA-DNA.

Quanto ao HIV, o híbrido resultante (RNA-DNA-biotina) é capturado por estreptavidina que recobre a superfície da microplaca.

Essa etapa também dura uma hora e é feita com o auxílio de Rotary-Shaker à temperatura de 20 a 25ºC.

4. Quarto passo: reação com conjugado

Adiciona-se solução contendo anticorpo monoclonal anti-RNA-DNA conjugado a fosfatase alcalina. Eles se ligam em diferentes sítios dos híbridos capturados resultando em uma amplificação de até 3000 vezes. Este passo requer trinta minutos em sua execução.

5. Quinto passo: detecção dos híbridos

Finalmente, adiciona-se o substrato quimioluminescente que, na dependência do agente pesquisado, pode ser o dioxetano ou o Lumiphos®. A fosfatase alcalina cliva o substrato produzindo luz, cuja intensidade esta na dependência direta da quantidade de enzima ligada ao complexo. A luz é medida pelos quimioluminômetros DML 2000 ou DCR-1 em RLU (Relative Light Units). Essa etapa requer período de incubação de 15 a 30 minutos.

A leitura é totalmente automatizada. Os valores lidos pelo quimioluminômetro são transmitidos a um computador, dotado de software específico, que analisa os números recebidos e faz os cálculos de validação do ensaio e a quantificação dos controles positivos, negativos e amostras. O valor do cutoff da reação é expresso pela média dos controles positivos. É importante destacar que o software executa o relatório final do teste e sua impressão, não havendo margem de erro nos cálculos.

6. Controles do teste

O ensaio conta com controles negativos e positivos, que são testados em triplicata. As leituras dos controles são utilizadas para a validação e o cálculo do cutoff. Para validação, os critérios abaixo devem sempre ser observados:

O coeficiente de variação das leituras entre os micropoços dos controles negativos e positivos não deve ultrapassar 25%.

A divisão da média das leituras de RLU dos controles positivos pelos negativos deve ser superior a 2,0

Os controles negativos devem respeitar o limite máximo de background de 250 RLU.

Há ainda dois outros controles intrateste. O primeiro é quando se faz a adição do reagente de desnaturação. Toda as amostras devem tornar-se de cor roxa, isso dá a certeza de que todo material será desnaturados. O segundo, quando da adição das sondas, a coloração deve mudar de roxo para amarelo, assegurando que todas as amostras receberam a quantidade ideal de sonda.

7. Vantagens laboratoriais

É uma tecnologia universal para a detecção de ácidos nucléicos.

A realização do teste em microplaca do tipo enzima-like é um diferencial, pois a maioria dos profissionais de laboratório já esta acostumada a ela. Isso implica em menor tempo de treinamento e facilidade com o método.

Diferentemente do que ocorre com outras técnicas biomoleculares, não há necessidade de espaço laboratorial reservado e sofisticado, ou ainda, a preocupação com a inibição ou a contaminação cruzada das reações. Método de uso amigável e sem necessidade de grandes investimentos com infra-estrutura, é ideal para ser usado na rotina laboratorial.

Realizado em quatro horas, permite a liberação dos laudos no mesmo dia com resultados consistentes ensaio a ensaio e lote a lote.

As amostras não necessitam de sofisticados preparos e todas as etapas da Captura Híbrida, para todos os agentes disponíveis, HPV, Clamídia, Gonococos, HBV, CMV e HIV, são as mesmas, possibilitando a padronização da técnica.

8. Vantagens clínicas

Diferente do que ocorre com as técnicas que utilizam sondas de DNA, com tendência a formar dupla hélice e, por isso, com sensibilidade menor que a obtida com métodos mais diretos e simples (reações antígeno-anticorpo), a Captura Híbrida trabalha com sondas RNA longas de alta estringência, o que aumenta a acurácia do teste.

Realizado em curto espaço de tempo, permite que o diagnóstico seja conhecido no mesmo dia, o que agiliza a conduta terapêutica.

Método de amplificação do sinal dos híbridos formados determina, com precisão, a quantidade real dos patógenos presentes.

Por não apresentar a possibilidade de contaminação na coleta e em seu processamento, não se verifica falso-positividade.

Método de amplificação do sinal, não utiliza enzimas do tipo polimerase em suas reações. Com isso, a existência de enzimas proteolíticas inibidoras, presentes em diferentes tecidos como no colo uterino, não induz ao aparecimento de falso-negatividade.

No que respeita aos agentes disponíveis para diagnóstico clínico, algumas peculiaridades devem ser abordadas

9. Papilomavírus humano (HPV)

A Captura Híbrida por ser estandardizada, fácil de usar, apresentar rapidez de resultados, alta sensibilidade e especificidade e comprovada correlação clínica, é o teste diagnóstico mais eficaz para esse vírus. Além disso, é único teste de biologia molecular para HPV aprovado para uso clínico tanto pelo FDA como pelo Ministério da Saúde.

Possui 18 tipos virais agrupados em dois pools de sondas. As sondas para os vírus de baixo risco incluem os tipos 6, 11, 42, 43 e 44 e, a de alto risco, tem os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68. O kit diagnóstico permite 42 determinações por ensaio para vírus de baixo e alto risco ou, 90 para os de alto. A sensibilidade é de 1pg/ml, equivalente a 0,1 cópia de vírus por célula.

Quanto à coleta, fundamental para o perfeito diagnóstico, deve ser realizada em kit coletor especial, composto de um tubete com solução conservadora e uma escova ou cotonete.

Os seguintes passos devem ser seguidos para a coleta de material do trato genital inferior.

Colo uterino e/ou vagina

Esfoliado celular

É necessária abstinência sexual de três dias e a paciente não deve estar menstruada

Não efetuar exame digital (toque), colposcopia ou assepsia prévia

A presença de sangue ou de conteúdo vaginal alterado não interfere no resultado

Introduzir toda a escova no canal cervical e rodá-la cinco vezes no sentido horário. A seguir, escovar a ectocervix e, se desejar, as paredes vaginais

Imediatamente após a coleta inserir a escova no tubete, dentro da solução tampão, quebrar a haste da escova e fechar o tubete. Agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra.

Vulva

Material do intróito vulvar pode ser obtido diretamente com a escova

Nas outras regiões, deve-se umedecer a área com solução fisiológica e efetuar um raspado com lâmina de vidro ou bisturi. A seguir, com o auxílio da escova, coloca-se o material e a escova no interior do tubo

Imediatamente após a coleta inserir a escova no tubete dentro da solução tampão, quebrar a haste da escova e fechar o tubete. Agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra

Quanto ao aparelho genital masculino deve-se agir da seguinte forma:

É necessária abstinência sexual por três dias

O material da glande, sulco bálano-prepucial, uretra e bolsa testicular pode ser coletado com a escova

Para a coleta uretral com escova, indica-se a utilização prévia, por cinco minutos, de solução líquida de lidocaína a 2% sem vaso-constritor. Preferentemente, este material deve ser coletado com o kit que exclui o cotonete de Dacron

Imediatamente após a coleta inserir a escova/cotonete no tubete, dentro da solução tampão, quebrar a haste da escova/cotonete e fechar o tubete. Agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra

Nas outras regiões do pênis, deve-se umedecer a área com solução fisiológica e efetuar um raspado com lâmina de vidro ou bisturi. A seguir, com o auxílio da escova/cotonete, coloca-se o material e a escova/cotonete no interior do tubo

Os materiais colhidos dessa forma devem ser enviados ao laboratório o mais breve possível. À temperatura ambiente sua viabilidade é de 15 dias. Quando o tempo decorrido entre a coleta e a chegada ao laboratório for superior a esse período, o espécime deve ser conservado em geladeira (de 2 a 8 ºC).

Biópsia

Não deve ter mais que 5 milímetros de diâmetro

Caso o material não seja entregue ao laboratório dentro de 24 horas, deve-se congelá-lo (-20 ºC) e assim encaminha-lo para análise

10. Clamídia e gonococos (CT/GC)

Clamídia e Gonococos são bactérias comuns que infectam o trato genital inferior. Ambos patógenos são de grande interesse, pois se propagam rapidamente na população jovem sexualmente ativa e, a maior percentagem, principalmente na infecção por Clamídia, cursa de forma assintomática com as complicações sobejamente conhecidas. Por isso, tem-se indicado o rastreamento rotineiro desses agentes para a população de não-risco e naquela onde a prevalência é baixa.

A Captura Híbrida usa somente uma amostra para screening dessas bactérias ou as identifica em separado. Com a mesma amostra pode-se detectar, além de CT e GC, o HPV e o HSV, evitando-se, assim, o retorno da paciente para uma segunda coleta.

O kit diagnóstico realiza 90 testes por ensaio com sensibilidade de 1pg/ml, equivalente a 0,1 cópia de bactéria por célula.

A coleta de material do canal endocervical se faz com escova apropriada. Para o homem, deve ser colhido de 20 a 30 mililitros de urina (1º jato) em recipiente estéril, sem conservante.

Citomegalovírus (CMV)

Atualmente o CMV é considerado como um dos principais causadores de doenças no homem. O risco de infecção começa já na vida intra-uterina e no período perinatal. Pode permanecer latente, reativando-se na vigência de doenças imunodepressoras como a AIDS e em pacientes órgãos-transplantados. A maioria é assintomática.

Para esse agente, a Captura Híbrida é utilizada para o diagnóstico de precisão e o controle terapêutico pela medida das variações da carga viral.

O teste é feito pela coleta de sangue total em tubo com EDTA, que pode ser armazenado por até seis dias a 4 ºC. Os leucócitos são separados por centrifugação, formando um botão que pode ser testado imediatamente ou armazenado a menos 20 ºC por até dez semanas.

O ensaio pode ser feito tanto na forma qualitativa como na quantitativa. Nos testes qualitativos, realizam-se 54 exames e, nos quantitativos, 48 amostras são analisadas. A sensibilidade é de 2,1 pg/ml, equivalente a 5×10 4 cópias/ml. Os resultados são fornecidos em número de genomas/teste e número de genomas/ml.

12. Hepatite B (HBV)

Infecções por HBV são comuns causando hepatite aguda e crônica, com potencial de desenvolver cirrose hepática e carcinoma hepatocelular.

Marcadores sorológicos como HbsAg, anti-HBs, HbeAg, antiHBeAg, anti-HBc, e IgM anti-HBc são utilizados rotineiramente no diagnóstico e como indicadores do prognóstico. O HbsAg é o primeiro e mais comum marcador a aparecer no soro de pacientes com hepatite B aguda, enquanto que, o HbeAg, é o segundo antígeno circulante nessa infecção. São usados para indicar a replicação viral ativa e estão associados com doença hepática progressiva. No entanto, estes testes não são fidedignos. Apesar de sua replicação no fígado e da presença de partículas virais na circulação, algumas variantes do HBV produzem HbeAg não detectável no soro. Por isso, no monitoramento dos pacientes com infecção crônica a quantificação do HbeAg tem utilidade limitada.

O advento da biologia molecular possibilitou o diagnóstico e a quantificação segura dos níveis de DNA-HBV no soro, importante referência para o monitoramento do tratamento com drogas antivirais. A Captura Híbrida foi desenvolvida para esse fim, possuindo sonda RNA “full-length”, altamente específicas, para detectar os subtipos ad e ay.

Para a análise, utiliza-se o soro que pode ser armazenado ou transportado entre dois a 8 ºC por até 72 horas. Após esse período, o material deve ser congelado a menos 20 ºC. O volume usado é de 30 ml para o teste standard e de 1ml para o ultra-sensível. Com o kit diagnóstico se faz até 82 determinações. O teste standard tem sensibilidade de 1,42×10 5 a 1,7×10 9 cópias/ml (0, 5 a 6000 pg/ml) e, o ultra-sensível, de 4,7×10 3 cópias/ml (0,017 pg/ml).

13. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

As infecções pelo HIV apresentam algumas peculiaridades que tornam seu diagnóstico laboratorial especialmente importante. Sabe-se que o período médio transcorrido entre a infecção e o início das manifestações clínicas é de 10 anos. Durante este tempo, elas podem estar completamente ausentes ou serem totalmente inespecíficas. Por outro lado, durante esta fase, os indivíduos infectados são potencialmente transmissores e há necessidade de identificá-los.

As técnicas para a detecção de anticorpos anti-HIV (Elisa) não diferem fundamentalmente dos demais recursos laboratoriais empregados em outras doenças. Usadas com finalidade diagnóstica ou de rastreamento em bancos de sangue, requerem correta interpretação e, quando da presença de reação positiva, há necessidade de confirmação por outras metodologias, sendo a reação de Western-blot a mais comumente empregada.

Até a pouco tempo, a avaliação da carga viral era feita indiretamente pela contagem das células CD4. Contudo, estudos mostraram que existem pacientes com CD4 alto e viremia também alta ou, até mesmo, com CD4 baixo e viremia baixa. Portanto, impôs-se a quantificação precisa do RNA viral circulante a fim de avaliar corretamente diversos parâmetros, entre eles a eficácia do tratamento.

Indubitavelmente, a biologia molecular trouxe benefícios incontestes. Com ela, pode-se acompanhar a dinâmica da doença e decidir sobre a melhor hora de intervir, além do que, avaliar clinicamente a progressão da doença.

A Captura Híbrida é um dos testes existentes para esse fim. Com quatro a sete mililitros de sangue coletado em tubo com EDTA, separa-se o plasma em até seis horas. Caso a reação não seja realizada de imediato, deve-se congelar o material a menos 20ºC. Com o kit se faz até 80 determinações, usado-se 16 controles. A sensibilidade é de 500 a 10 6 cópias/ml.

Importante salientar que mesmo com toda a evolução, não existe ainda um teste perfeito para esse vírus. Múltiplos fatores inerentes à técnica, ao vírus e ao hospedeiro prejudicam a correta avaliação. Soler et al. compararam as quatro técnicas laboratoriais disponíveis no momento. Os resultados de reprodutibilidade, coeficientes de variações e facilidade de execução, fizeram com que esses autores recomendassem a Captura Híbrida como primeira opção na medida de carga viral para o HIV.

14. Bibliografia recomendada

Dores, GB; Taromaru, EK; Gallo, C – Aspectos atuais do rastreamento das lesões HPV-induzidas e do câncer do colo uterino com métodos morfológicos e biomoleculares. Newslab, 35: 196-205, 1999.

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