MENSAGEM PRINCIPAL: Estudo que fala da importância do controle de qualidade nos testes de DNA-HPV, focando em lesões cervicais de alto grau e cânceres que inicialmente testaram negativo para o vírus.
A infecção persistente pelos vírus do papiloma humano (HPV) é uma causa primordial para o desenvolvimento do câncer de colo do útero. Entretanto, algumas lesões intraepiteliais escamosas de alto grau do colo do útero (HSIL) e cânceres cervicais invasivos podem apresentar resultados negativos para o HPV. As taxas de HSIL+ com HPV negativo variam de 0,03% a 15% entre os estudos. Nas reanálises de casos de HSIL+ inicialmente identificados como “negativos para HPV” demonstrou a presença de DNA do HPV em uma grande parte dessas amostras.
As Razões para Resultados Falso- negativos:
- Qualidade da amostra: Fixação ou armazenamento inadequados, presença de substâncias inibidoras, alta fragmentação de ácidos nucleicos, paucicelularidade da lesão, necrose ou amostra não representativa da área tumoral.
- Fatores clínico- patológicos: Diagnóstico histopatológico incorreto (ex.: lesões inflamatórias ou atróficas benignas interpretadas como HSIL), adenocarcinoma endometrial classificado erroneamente como endocervical, metástases ou tumores cervicais primários não epiteliais (sarcomas/linfomas).
- Limitações dos ensaios moleculares: Sensibilidade analítica insuficiente, falha na extração, genótipos oncogênicos raros não cobertos pelo painel do teste comercial, ou deleções/mutações na região genômica alvo (ex.: perda do gene L1 por integração viral).
- Verdadeira negatividade viral: Clareamento imunológico do vírus (clearance) prévio à regressão tecidual da lesão, perda do genoma viral durante a progressão tumoral ou carcinomas cervicais raros independentes de HPV
A garantia de qualidade clínica e laboratorial é crucial para assegurar que os programas de rastreamento do câncer cervical baseados no teste de HPV sejam eficazes e seguros. Na Suécia, o monitoramento de rotina e a retestagem de casos de HSIL+ inicialmente “negativos para HPV” tornou-se uma exigência nacional da Agência de Saúde Pública da Suécia em 2019.
Objetivo do artigo foi compartilhar os dados focado no monitoramento contínuo de casos de HSIL+ negativos para HPV. Formular um guia padronizado para que os serviços de teste e rastreamento de HPV possam implementar a reanálise de casos de HSIL+ “negativos para HPV” no seu fluxo de controle de qualidade.
Quando um laboratório na Suécia identifica um diagnóstico de HSIL+ em uma mulher com um teste de rastreamento de HPV anterior negativo, a amostra residual de rastreamento e/ou o tecido diagnóstico é enviado ao Laboratório Nacional de Referência para HPV (NRL) para retestagem. Foram incluídas 116 amostras cervicais com diagnóstico inicial “negativo para HPV” (provenientes de 82 pacientes), entre 2019 e 2022. Neste total de espécimes foi composto por 85 amostras de citologia em meio líquido (48 no meio PreservCyt/ThinPrep e 37 no meio SurePath) e 31 amostras de tecido fixado em formalina e incluído em parafina.
Todas as amostras apresentavam adequação do DNA celular (beta-globina positiva, controle interno, DNA celular humano suficiente na amostra). As amostras adequadas foram amplificadas utilizando os primers consensuais MGP5+/6+, cujo alvo é um fragmento de 160 pares de bases no gene L1 do HPV. O produto amplificado foi submetido a hibridização com sondas tipo-específicas acopladas a esferas Luminex, permitindo a identificação de 37 genótipos de HPV. As amostras que mantiveram resultado negativo no teste de PCR/Luminex foram submetidas ao sequenciamento do genoma completo.
- A reanálise ampliada identificou o DNA do HPV em 61,2% (71/116) das amostras originalmente classificadas como negativas (correspondendo a 51 de 82 mulheres).
- 29,3% (34/116) de todas as amostras falso-negativas continham tipos de HPV de alto risco/oncogênicos (como HPV 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58, 39, 51, 56, 59 e 68).
- 55,2% (64/116) das amostras foram resgatadas utilizando um teste de PCR consensual padrão para o gene L1 (MGP5+/6+ / Luminex), sem necessidade de tecnologias complexas.
- Sequenciamento Genômico (WGS): Das amostras que mantiveram resultado negativo na PCR, o sequenciamento profundo (RNA-Seq / WGS) identificou o vírus em 15,2% adicionais (7/46).
- Verdadeira Negatividade: 38,8% (45/116) das amostras mantiveram-se confirmadas como verdadeiramente negativas para HPV mesmo após o sequenciamento genômico completo.
Algoritmo de Investigação em 5 Etapas
Para casos de HSIL+ confirmados com teste de HPV prévio negativo, recomenda-se a seguinte abordagem sequencial:
- Repetição do teste primário: Retestar a amostra residual (ou o tecido biopsiado) na mesma plataforma ou em plataforma validada equivalente.
- Ensaio com alvo alternativo: Utilizar teste com amplicon menor ou direcionado a outra região genômica (ex.: genes E6/E7 em vez do gene L1).
- Painel estendido de genótipos: Utilizar teste que inclua genótipos adicionais classificados pela IARC como oncogênicos ou prováveis oncogênicos.
- Revisão histopatológica (“Método Sandwich“): Recuperar o bloco de parafina e reavaliar cortes histológicos imediatamente anteriores e posteriores às seções testadas.
- Sequenciamento genômico completo (WGS): Em persistindo a negatividade e havendo material disponível, encaminhar a amostra a um Laboratório Nacional de Referência (NRL) para sequenciamento profundo.
Discussão e conclusão
Testes de triagem de HPV falsos negativos podem atrasar a detecção de cânceres cervicais, aumentando o número de mulheres que apresentam sintomas, estágio avançado de câncer e mau prognóstico. Um subconjunto de casos de câncer cervical parece ter perdido o DNA do HPV (eles testam HPV-negativo no diagnóstico, mas testaram HPV positivo em amostras anteriores de arquivo) e constituem um subgrupo de câncer cervical com pior prognóstico.9 Uma pequena proporção de cânceres cervicais de tipos histopatológicos específicos que não estão relacionados ao HPV parece existir. 7,14 Esforços ainda são necessários para explicar a falha na detecção do HPV em alguns cânceres do colo do útero. No entanto, o presente estudo mostrou que 29,3% (34/116) do HSIL+ inicialmente “HPV-negativo” são de fato positivos para um tipo oncogênico de HPV no novo exame. Surpreendentemente, a maioria foi detectada sem recorrer ao sequenciamento de todo o genoma, mas identificada com um PCR padrão visando a região L1. Amostras adicionais de HSIL+ foram encontradas positivas para HPV para tipos não incluídos em testes clínicos de HPV. Esses tipos devem ser monitorados para determinar se tipos adicionais precisam ser adicionados à triagem/triagem. No entanto, mesmo após o novo teste, quase 40% (45/116) das amostras de HSIL+ referidas permaneceram negativas para HPV.
Como o HSIL+ “HPV-negativo” é relativamente raro e pode ser impulsionado por vários motivos, uma abordagem consensual para a anotação e descrição do HSIL+ “HPV-negativo” usando diretrizes, protocolos e definições padrão, e com uma visão geral internacional, tem valor. Estratégias de garantia de qualidade que incluem uma nova análise do HSIL+ “HPV-negativo” são essenciais para manter o alto desempenho dos serviços de teste de HPV e a confiança contínua do público na triagem baseada no HPV e na vacinação contra o HPV.
Dra. Ana Carolina Sica
- Mestrado em Ciências da Saúde na Irmandade Santa Casa de São Paulo
- Doutoranda em Ciências da Saúde na Irmandade Santa Casa de São Paulo
- Preceptora voluntária do Setor de Patologia do Trato Genital Inferior e Colposcopia da Santa Casa São Paulo
Fonte: Prétet JL, Arroyo Mühr LS, Cuschieri K, Fellner MD, Correa RM, Picconi MA, Garland SM, Murray GL, Molano M, Peeters M, Van Gucht S, Lambrecht C, Broeck DV, Padalko E, Arbyn M, Lepiller Q, Brunier A, Silling S, Søreng K, Christiansen IK, Poljak M, Lagheden C, Yilmaz E, Eklund C, Thapa HR, Querec TD, Unger ER, Dillner J. Human papillomavirus negative high grade cervical lesions and cancers: Suggested guidance for HPV testing quality assurance. J Clin Virol. 2024 Apr;171:105657. doi: 10.1016/j.jcv.2024.105657. Epub 2024 Feb 20. PMID: 38401369